地区：上海市 宝山区
关键词：江南大学
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000000490
成果描述：
| L-精氨酸是中国食品和医药用氨基酸生产中“瓶颈”品种之一，2012年中国精氨酸需求量为4000吨，价值约5亿元，其中80％依赖于进口。该课题组在国家863探索导向(2007AA02Z207)等项目的资助下针对食品和药用氨基酸生产的“瓶颈”品种L-精氨酸的新菌种——钝齿棒杆菌中L-精氨酸的合成代谢途径及调控机理进行了较深入研究，进行了产物反馈抑制的分子改造、代谢支路敲除等一系列代谢工程改造，并对重组菌进行了培养基组成及发酵工艺优化的研究：钝齿棒杆菌新型遗传表达体系的建立及vgb基因的表达。以具有自主知识产权的高产精氨酸钝齿棒杆菌SYPA5为出发菌株，研究团队以氯霉素乙酰转移酶基因(cat)为报告基因，成功构建了含不同启动子的钝齿棒杆菌表达系统。构建重组菌SYPA5(pJC1-tac-vgb)并对其发酵特性进行了初步分析，产酸能力比对照提高13.0%。上述研究结果授权国家发明专利1项。钝齿棒杆菌精氨酸合成途径基因簇argCH克隆表达及功能分析。克隆并表达了钝齿棒杆菌由谷氨酸合成精氨酸途径酶编码基因簇argCH，确定钝齿棒杆菌SYPA为抗反馈阻遏型突变株。分别在钝齿棒杆菌中加强表达argC～argH并进行了酶学性质分析，对重组菌进行发酵产精氨酸研究。上述研究结果申请国家发明专利2项。钝齿棒杆菌精氨酸合成关键酶NAGK抗反馈抑制定点改造。在氨基酸同源性比对和三维结构建模基础上，共设计了16个突变型NAGK，确定在对其N-螺旋附近的E19，H26和H268点突变后NAGK受L-精氨酸的I0.5R提高了150-250倍，在此基础上，获得NAGK36 (E19R+H26E+H268N)，其I0.5R为784 mM，比未突变前的0.4 mM提高了1960倍，可达到解除钝齿棒杆菌胞内受L-精氨酸反馈抑制作用的目标。结果申请国家发明专利1项。钝齿棒杆菌不同溶氧条件下的差异蛋白质组学研究。对高产精氨酸的钝齿棒杆菌在不同溶氧条件下的差异蛋白质组学进行研究2-DE、质谱鉴定及数据库检索等技术，对不同供氧条件下该菌株胞内可溶性蛋白的差异分析。共鉴定了109个差异蛋白，包括与碳源代谢、氨基酸代谢、能量代谢、翻译相关、次级代谢相关的蛋白及一些未知功能的蛋白。通过代谢途径分析发现：这些差异蛋白主要集中在HMP途径、TCA循环和尿素循环。基于精氨酸代谢网络定量分析提出两步供氧策略。对不同供氧条件下该菌株代谢流量分配进行分析后发现：高供氧(HOS)条件下L-精氨酸的产量得到了提高；在发酵的后半阶段，中供氧(MOS)比高供氧(HOS)更有利于稳定的L-Arg积累，因此提出了两步法供氧控制策略，使L-精氨酸的产量比HOS和MOS分别增加了16%和51%。而且葡萄糖的消耗速率的明显增加，发酵周期仅为81 h，比HOS条件下提前了6 h。上述研究结果申请国家发明专利1项。构建高产L-精氨酸重组钝齿棒杆菌。工程菌精氨酸的反馈抑制解除，进入精氨酸的积累期后重组菌中精氨酸的合成明显优于原始对照菌株，在重组菌中抗反馈抑制型基因簇的过量表达，精氨酸大量积累时，L-Arg的后期合成不受其胞内外高浓度Arg的反馈抑制。工程菌的L-Arg产量为50.12 g/L，比出发菌株提高了38.2%，其糖酸转化率为33.4%。该成果已经完成5L发酵罐小试和500L发酵罐中试。申请国家发明专利8项，授权2项，获得了国内产量最高的精氨酸生产菌株，该菌株在500L发酵罐上L-精氨酸产量达到50g/L以上，糖酸转化率超过33%。并成功转让到发酵企业，产业化正在进行之中。 |
