地区：上海市 宝山区
关键词：库尔勒出入境检验检疫局
成果类型：其它
成果领域：生物与新医药
成果编号：A2021061000001569
成果描述：
| 库尔勒香梨是新疆巴州特色优质水果，已出口至东南亚、美洲、澳洲等20多个国家，是新疆出口创汇的重要农产品。在出口香梨检验检疫过程中，蛀果性害虫的幼虫大量出现，有时是幼龄幼虫，有时仅剩幼虫残体，时常无法鉴定，而香梨进口国在实施检验检疫时，常常对蛀果性害虫幼虫给出错误的鉴定结果，提出种种限制性技术措施，变相阻止香梨出口。苹果蠹蛾、梨小食心虫和香梨优斑螟是在香梨上普遍发生的蛀果性害虫，他们幼虫形态非常相似，利用传统形态学方法很难鉴定。鉴定方法不成熟和分辨率低大大增加了香梨出口的风险。为在国际贸易谈判中抢占技术制高点，降低香梨的出口风险，需要针对这3种害虫建立简易可行、准确快速的实验检测平台，精确区分出口香梨中存在的形态学相似的有害生物，2013年库尔勒市科技局下达“分子生物学技术在香梨蛀果性虫害诊断中的应用”科研计划项目。该项研究首先通过采集苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫等蛀果性害虫不同发育时期的活体样本和虫体残骸样本，根据NCBI等数据库所报道的16SrDNA序列，用BLAST和DNA-star等软件对COI序列进行比对分析，发现不同来源的苹果蠹蛾、梨小食心虫和香梨优斑螟的COI区域均具有较高的保守性。通过测序比对分析筛选出3中蛀果性害虫具有差异位点的种间变异区，而且在种内十分保守，进而采用此差异性序列，设计特异性引物并经常规定性PCR扩增验证。从而设计引物扩增这3种害虫的细胞色素C氧化酶亚基I(COI)片段，在此基础上设计各种害虫特异性的PCR引物和荧光探针。通过样品核酸提取与质控，特异性荧光探针的设计与验证，反应条件和反应体系的优化，特异性、重复性和灵敏性的试验比对分析，开发出实时荧光PCR检测技术方法。将该方法应用于盲样检测验证，得出结论与形态学鉴定结果一致。该方法操作简单易行，能够在较短时间内(约3小时)完苹果蠹蛾，香梨优斑螟、梨小食心虫的虫体鉴定，一次可检测多个样品，特别适合于大批量的抽样检查。该项目通过分子生物学手段寻找香梨蛀果性害虫线粒体DNA序列的微小差异和特征序列；设计种属特异性的引物和荧光探针；开发蛀果性害虫的实时荧光定量PCR检测方法。在后续的工作中课题组将继续探索多重荧光定量PCR实验体系，努力为蛀果害虫的检验检疫工作开发更为简洁、精确的实验检测体系。该项目已获国家发明专利一项，正申报待批国家发明专利一项。在核心期刊发表科研论文一篇，编写该实验室操作规程一个，研究的方法在多个检验检疫部门和生物技术公司应用。 |
